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均質ポリマー連鎖反応（POLYMER CHAIN REACTION ）｛ピーシーアール（PCR） ｝フラグメントの同定 本発明が均質ピーシーアールフラグメントの同定に適用された。本方法は最初 にデーエヌエイ溶解カーブ（DNA melting curve）の情報豊富な部分を同定し、 次いで該入力スペクトラムの情報豊富な部分集合を使用して最適モデルを発展さ せる。 背景 デーエヌエイフラグメント同定は伝統的にゲル電気泳動（gel electrophoresi s）により行われて来た。挿入染料（intercalated dyes）を使用する代替え方法 はあり得る時間と感度での利点を提案している。この方法は、加熱時２重螺旋デ ーエヌエイが変性する（捲きほごれる）と該染料蛍光量（dye fluorescence）が 減少することの観察に基づいている。温度に対する蛍光量をプロットする、最終 のいわゆる”溶解曲線（melt curve）”のデータ解析は該デーエヌエイフラグメ ントのユニークな同定のベースを提供する。しかしながら、該方法は、特定的デ ーエヌエイフラグメントの精確な同定を、他の非特定的フラグメントの存在及び 背景基盤（background matrix）からの蛍光ノイズの存在の両場合で、要求して いる。 スパイク（spiked）される食料サンプルの準備 この研究はピーシーアールを禁ずる知られる食料を評価した。該評価は、該禁 止食料の禁止効果を克服するために、該反応へのウシ血清アルブミン（bovine s erum alubumin）｛ビーエスエイ（BSA）｝の添加能力をテストした。加えて、溶 解曲線解析を使用したピーシーアール製品の均質性検出が臭化エチジウム染色（ ethidium bromide staining）を有する標準的ゲル電気泳動と比較された。, トップ10ビットコインギャンブルサイトはサイコロを信頼する. 食料は地域の食料雑貨店で購入され、４℃で貯蔵された。３０の異なる食料が ビーエイエム（BAM）手順で事前強化（per-enriched）された。処方された強化 法（enrichment）に従い、サンプルはサルモネラニューポート（Salmonella new port）でスパイクされるか又はスパイクされずに残されたが、表ＩＩＩ参照。該 強化は次いでビーエイチアイ（BHI）｛デーアイエフシーオー（Difco）｝内で１ ：１０に薄められ、次いで３７℃で３時間培養された。 ポリビニルポリピロリドン（Polyvinylpolypyrrolidone）｛ピーブイピーピー（ PVPP）｝処理 グローバックサンプル（growback）の５００マイクロリットル（500 ul）のア リコート（aliquot）がピーブイピーピー｛クアリコン社（Qualicon, Inc.）｝ の５０ｍｇのタブレットを含むチューブに追加された。該チューブはボルテック ス（vortexed）されそして該ピーブイピーピーは１５分間澄むようにされた。最 終浮遊物は次いで溶解過程で使用される。 サルモネラサンプルの準備 ２ｍｌのスクリューカップチューブ（screw cup tube）で、強化すなわちピー ブイピーピー処理サンプルの５マイクロリットルがデーエヌエイ挿入染料エスワ イビーアールグリーン（DNA intercalating dye SYBR R Green）｛モレキュラー プローブ（Molecular Probes）｝の１：１０、０００希釈を含む溶解試薬｛５ｍ ｌビーエイエックス溶解バッフアー（5ml BAX R lysis buffer）と６２．５ｕｌ （マイクロリットル）ビーエイエックスプロテアーゼ（62.5 ul BAX R Protease ）｝の２００ｕｌ（マイクロリットル）に加えられた。該チューブは３７℃で２ ０分間次いで９５℃で１０分間培養された。９５℃の培養の後、４ｍｇ／ｍｌの ビーエスエイ（BSA）溶液の５０ｕｌ（マイクロリットル）が該溶菌液（lysate ）に追加された。これはピーブイピーピー処理済みと未処理のサンプルに行われ た。対照として、幾つかのサンプル未処理で残された。この未精製バクテリヤ溶 菌液の５０マイクロリットルが、パーキンエルマー７７００シークエンスデテク ター計器（Perkin Elmer 7700 Sequence Detector instrument）で使用されるピ ーシーアールチューブ内に含まれた１つのビーエイエックスサルモネラサンプル タブレット（BAX R Salmonella sample tablet）を水和するため使用された。該 チューブはキャップを付けられ、パーキンエルマー９６００サーマルサイクラー （Perkin Elmer 9600 thermal cycler）内で次のプロトコルに依り熱サイクルに かけられた。 ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７２℃ ３．０分 ７２℃ ７分 １サイクル ４℃ ”長期間（forever）” 増幅後分析（Post Amplification Analysis） 増幅後、下記条件で運転することによりパーキンエルマー７７００デーエヌエ イシークエンスデテクター（Perkin Elmer 7700 DNA Sequence Detector）上で 該溶解曲線が作られた。 http://lovetailskc.com/forums/community/profile/forocasinojp2032695/
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